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今天主要介紹下影響其分離效果的主要因素：

流速對分離效果的影響較大，所以在洗脫分離蛋白質樣品時保持合適而恒定的流速非常重要。凝膠色譜系統中洗脫流速主要取決于凝膠柱的內徑和高度、凝膠種類、顆粒大小以及分離類型等。一般在開始正式洗脫之前，先要進行預備試驗以確定合適的流速。較緩的流速可使蛋白樣品與凝膠基質充分平衡，達到理想的分離效果，但是流速過低會造成樣品在凝膠床內的橫向擴散增大，使峰寬變寬，降低分辨率。此外，還延長了洗脫時間，降低工作效率。高流速易引起洗脫峰的重疊，使本來可分開的組分重合，而且會增大柱壓，影響分離效果。一般凝膠的線性流速控制在2-10cm/h。商品凝膠出廠時，商家提供的一些流速參數可供使用者參考。在一般實驗中通常用蠕動泵調節流速，沒有條件的可通過控制一定的高度壓差來控制流速。在實驗中通常使用體積流速 （mL/min），有時為了實驗需要，還需將體積流速轉換成線性流速（cm/h），其轉換公式如下：

加樣體積 （Vs）也可對蛋白樣品的分離效果造成較大的影響。體積過大，會造成平臺洗脫峰或相鄰峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，目的蛋白組分的收集量少、稀釋倍數增大、濃度低，降低實驗效率。

樣品進樣前應高度濃縮，但是濃度不可過大，否則會影響分離效果。蛋白質濃度應小于70mg/mL，一般在10-20mg/mL。必要時，需進行樣品濃度系列試驗，以確定更佳值。過低的樣品濃度可造成某一蛋白組分的過度稀釋，影響收集；而濃度過高時會使流動相不穩定，造成洗脫峰的變形或重疊。此外，樣品濃度還和分離純化的類型有關，進行蛋白組別分離或脫鹽除雜時，由于目的蛋白和雜質的分子量差異較大，故可適當提高樣品濃度，而進行分子量差異較小的分級分離或分析性實驗時，樣品濃度盡量要低一些。

樣品洗脫液中含有一定離子強度的鹽溶液可防止蛋白質與蛋白質之間或蛋白質與凝膠介質之間的相互作用，排除蛋白質與流動相或與凝膠介質相互作用的干擾。一些不帶電荷的中性蛋白在純水中可實現有效分離，而在分離一些帶電荷的蛋白質樣品時特別要注意這一影響，一定要調整洗脫液的離子強度，排除離子吸附等干擾。例如，Tandex因含有羧基基團，呈弱酸性，所以在用該類凝膠進行色譜操作時常使用一定離子強度的鹽溶液 （一般高于0.05）作為洗脫液，這樣就可以避免Tandex與堿性蛋白發生吸附。在分離純化蛋白質時一般使用20-100mmol/L NaCl作為鹽溶液。但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積的變化。

由于在凝膠過濾色譜中所用的平衡液和洗脫液一致，故在整個操作中pH不發生變化，選用具有一定緩沖能力的緩沖液即可達到控制pH的目的。維持洗脫液一定的pH，一方面是考慮蛋白質樣品的穩定性和溶解性，需盡量避開靠近蛋白樣品等電點的pH范圍，以防蛋白質沉淀。另一方面，平衡、洗脫中pH的變化會造成凝膠床體積的變化，影響分離純化的效率和效果。所以在確定pH時要考慮蛋白質樣品性質和凝膠所能耐受的pH范圍這兩方面的因素。pH一般控制在6-8，磷酸鹽和Tris-HCl緩沖液的使用較多。生產商家提供的一些凝膠所適合使用的pH范圍可供參考。

溶質的大小和分子量主要取決于分子形狀，洗脫液中所溶解的蛋白質具有各種不同的分子形狀 （如球蛋白、微不對稱球蛋白、含纖維桿狀蛋白和變性后的彎曲結構等），而在理想的凝膠過濾色譜中，蛋白質為球形分子，在柱內的保留時間僅與其分子大小和凝膠孔徑大小之間的差別有關，所以不同形狀的蛋白質分子對分離也有不同程度的影響。在測定一些非球形蛋白質分子量的實驗過程中，通常在樣品中加入高濃度的變性劑 （如8mol/L尿素），使各蛋白組分發生卷曲后，分子形狀趨于一致。

除以上因素之外，操作溫度、凝膠顆粒的種類和直徑、柱子的長度和內徑等都對蛋白質樣品的分離效果有影響。在操作過程中保持合適的溫度對分離非常重要，操作溫度要 控 制 在凝膠的更適用范圍內，否則會影響到凝膠分級范圍、排阻ji限的準確性和柱床體積的變化。

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