提示
蛋白結合的解離常數以及在蛋白檢測和親和分離中的應用
2022-01-18
蛋白與配體能否結合、結合的強弱會直接影響蛋白檢測或純化實驗的成敗。此篇文章由月旭科技首席科學家王國斌博士執筆，對蛋白結合和解離常數進行了較為系統的講述。
蛋白和配體結合的強弱不同，對于蛋白檢測以及親和分離純化實驗有顯著影響。在設計實驗時應考慮這種結合強弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括更低檢測限濃度），估算結合時間，獲得更佳并且實用的結果。 這對于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持更高活性蛋白的純化尤為重要。
常規的蛋白檢測方法，比如ELISA，只能測定實驗結束時的蛋白結合數值，不能跟蹤整個過程。這不利于獲取結合的動力學數據，阻礙了實驗的優化。自從上個世紀90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術后，目前已有幾種生物傳感器技術，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結合過程，檢測結合的全部過程，給出結合的動力學數據。下圖是我在SRU Biosystems用光學生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時間變化的結合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結合在2-3分鐘內迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時，結合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結合在180分鐘內持續穩定地增加。濃度小于1μg/mL時，結合仍然進行，但是十分緩慢。
圖1. 10種濃度的人類IgG與光生物傳感器表面
的蛋白A結合的real-time時間曲線。
IgG濃度從100μg/mL，做1:2稀釋，
直到0.09μg/mL（90ng/mL）和0對比。
絕大多數生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，確定蛋白的濃度和結合時間通常根據結合的強弱來確定，而結合強弱是通過解離常數來判斷的。
在化學、生物化學中，解離常數（KD) 是一種反應的平衡常數，用于測量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數是結合常數的倒數。 雖然解離常數是動力學理論的參數， 但是它在生物化學，尤其實驗設計上有現實意義的指導作用。
對于一個可逆的蛋白結合過程
（1）P+L?P L
PL是蛋白P和配體L的親和產物。解離常數KD定義為
（2）KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA
其中[P]e’[L]e和[PL]e分別是到達平衡時，P、L和結合物PL的濃度。KA是結合常數。結合率?定義為蛋白P與配體L結合成PL的比例。
（3）?=[PL]_e/[P]t
[P]t是起始的蛋白P總濃度。平衡時蛋白濃度
（4）[P]e= [P]t-[PL]e
等式（2）變成
(5) KD=（[P]t-[PL]_e）[L]e/[PL]
等式（5）變成
(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
結合率?轉化為
（7） ?=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
平衡時省余未結合配體濃度
（8）[L]e=? KD/(1-?)
當蛋白L有一半結合時，?=0.5
（9） [L]e=KD
更后平衡狀態結合配體的濃度就等于解離常數。下面闡述其實用價值。
圖2. 不同配基濃度和蛋白結合率?。
KD=1nM——；KD=5nM——
例如KD為1nM時，更后剩余的配基平衡濃度為1nM，一半的蛋白會與配體結合（?=0.5）。KD為5nM時，更后剩余的配體平衡濃度為5nM時，一半的蛋白會與配體結合（?=0.5）。如果想要提高蛋白結合率到六成（?=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達到更后配基平衡濃度分別為1.5nM（KD=1nM）和7.5nM（KD=5nM）。對于蛋白A填料來說，配體就是抗體，不同動物/總類的抗體有不同的KD。如果給與足夠時間，結合達到平衡后（靜態載量），沒結合抗體的濃度也不同。KD小，會有更高的靜態載量，分離得更完全。 要想提高低KD抗體的載量，只能提高填料表面蛋白A的密度。如果時間短，沒有達到更后的結合平衡，現實的例子就是抗體流過蛋白A填料柱。在相同時間里，KD小的，會有更多的抗體與蛋白A結合。對于同樣的KD流速低，時間長，動態載量也會更高。
反之， 在更后配體平衡濃度為8nM（圖中紅線）時，KD?。?/span>1nM）的蛋白結合率能達到0.89，而KD大（5nM）的蛋白結合率只有0.62。 這對于無蛋白檢測時，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測抗體）或者熒光標記的二抗以及鏈霉親和素（Streptavidin）濃度確定后，KD對蛋白（被檢測物）的濃度測定的影響就顯而易見。KD小的被檢測蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結合率高，檢測結果更準確。如果KD較大，就要提高二抗濃度，以確保檢測數據可信度，或者縮短實驗周期。
圖3. 蛋白結合強弱劃分定義
在分子生物學上，KD<10-8M (10nM或者0.01μM)屬于強結合； 10-4M>KD>10-8M屬于中等結合；KD>10-4M (0.1mM)屬于弱結合。蛋白A與不同種類抗體結合的強弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的KD約為2×10?9M，屬于強結合。下表列出不同抗體與蛋白A結合的強弱情況。蛋白檢測，分離純化過程中，應該參照結合強弱，設計操作方案。
鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學常用的試劑。它于生物素（biotin）結合的KD非常小，僅為~10?14M。 強度與共價鍵類似。前文介紹過，鏈霉親和素是非常穩定50KD蛋白，經常用來與熒光、紅外、ELISA標記等化學結合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學結合。這樣帶有標記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結合，從而避免直接標記蛋白。鏈霉親和素和生物素KD小。對比于直接標記二抗的方法，采用標記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時間短，達到準確檢測的目的。基于這種原因，標記的鏈霉親和素、化學活化的生物素以及生物素結合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買，這對于實驗方案設計非常便利。
作者?
王國斌，美籍華人博士，在生命科學和表面化學領域有著20多年的產品研發經驗。擁有反相表面聚合技術等多項發明專利，并有GRAFT-COAT?涂層技術和蛋白質的HydroGel?涂層載玻片等多款專利產品面世。曾就職于多家醫療器材和生物科技公司，包括Perkin Elmer和SRU Biosystems，參與開發了 BIND?生物傳感器。
王國斌博士憑借在高分子化學、表面科學、蛋白質兼容表面等方面的豐富經驗，在加入月旭科技后，主持研制了“續凈一號”銀離子消毒液，并對月旭科技的蛋白純化系列產品的研發提供了ji大的技術支持。為今后月旭科技在生命科學領域的發展注入一劑強心針。
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