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多肽分析過程中常見問題解讀

2020-12-14

小分子越來越難做，大分子發展很強勢，似乎成為了近年來藥物研發市場的重要表現之一，“多肽”類藥物正是其中的一大熱門。目前多肽藥物的質量監管日趨漸嚴，在這種趨勢下，尋找能滿足更高分離度，靈敏度的分析方法就顯得尤為重要。很多小伙伴在在開發多肽類樣品分析方法中總是遇到各種的問題，無比煩惱。這里小編就總結了一些在多肽方法開發中常見的問題分享給各位小伙伴。

1、多肽含量與多肽純度有什么區別？

一條多肽產品中除了多肽本身還包括生產過程中帶入的水份及有機鹽分等雜質，多肽純度僅指多肽本身所含肽產品的含量及雜質的含量，不包括水份等雜質；而多肽含量則是指目標多肽在產品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測；因此一條多肽即使純度達到99%，因為產品中還包含水份及有機鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。

2、如何溶解多肽？

多數多肽都可以用超純水溶解，對于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對于酸性多肽，可先以小量堿性（如0.1%氨水）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對于堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三fu乙酸）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對于疏水性多肽，可用有機溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。

3、為什么流動相中要加入三fu乙酸作為離子對試劑，還有哪些流動相體系或離子對試劑可用于多肽的分離純化？

加入三fu乙酸能調節洗脫液的PH，同時作為離子對試劑與多肽相互作用，從而增強分離效果，明顯改善峰形。

其它可用于多肽分離純化的流動相體系或離子對試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過適當的調節PH都能取得很好的分離效果。

另外三fu乙酸優于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發，可以方便地從制備樣品中除去，另一方面，三fu乙酸的紫外更大吸收峰低于200nm，對多肽在低波長處的檢測干擾很小。

4、檢驗多肽的色譜柱出現柱壓升高，柱效下降該如何解決？

日常對色譜柱沖洗維護可以遵循色譜柱出廠說明書，但是在分析多肽等蛋白質樣品時還容易出現一種現象：蛋白污染。主要是柱頭端填料出現結塊，如果出現蛋白污染，建議使用乙腈-水-三fu乙酸 = 50-50-0.1小流速反向沖洗60倍柱體積或者反向沖洗過夜。

5、多肽樣品在新的硅膠基質色譜柱上不出峰或者峰面積異常小，這是為什么？

這是因為全多孔球形硅膠柱上的非特異吸附位點對多肽產生死吸附從而導致不出峰。

色譜柱中非特異性吸附位點主要來源于殘留的硅醇基、硅膠中的殘留重金屬、鍵合相脫落后暴露的硅羥基，柱管內壁沒有被鈍化的位點。這些都會對多肽樣品有較強的非特異性吸附。

其實在開始使用新色譜柱時，對生物樣品這樣的非特異性吸附會比較嚴重，可以對色譜柱進行高濃度樣品飽和處理。在正式檢測前預先進樣，使樣品在柱子上累積，覆蓋住這樣的位點，才會使我們以后的分析有好的色譜圖。建議隔一分鐘進一次樣，連續進十幾針，用過量樣品覆蓋掉非特異性吸附位點。等峰面積，峰形穩定后就可以正式檢測樣品。

6、TFA在緩沖液中是不是只起到調節PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？

（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。

（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時沖洗色譜柱。

7、在多肽檢測過程中經常出現基線漂移的原因是什么？怎么解決？

固定三fu乙酸濃度的梯度洗脫有時會在210-220nm檢測處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。

降低或消除由于三fu乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測波長靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三fu乙酸補償基線漂移。例如溶劑A中的三fu乙酸為0.1%時，溶劑B中可用0.085%。

8、如何選擇純化過程中使用的色譜柱填料？

不同序列的多肽理化性質及疏水性有很大的區別，多數情況分子量小于4000和親水性多肽用Ｃ18柱分離效果z佳，分子量大于5000和j端疏水性的多肽以Ｃ4柱分離效果z佳，而Ｃ8柱介于Ｃ18和Ｃ4柱之間，其應用效果與Ｃ18柱更相似；對一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱。

9、另附有生物樣品分析過程中常見問題和解決建議

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