提示
“化繁從簡”——食品中脫氫乙酸檢測的前處理優化
2020-01-16
更近，小編在按照標準方法《GB 5009.121-2016 食品安全guo家標準 食品中脫氫乙酸的測定 第二法 液相色譜法》做不同的食品基質中脫氫乙酸的檢測實驗時發現，標準方法中處理果汁、烘焙食品、黃油等樣品的操作流程非常繁瑣、耗時長、誤差不可控的步驟過多，且回收率不理想。
因此，小編依據脫氫乙酸的性質對實驗過程進行改動優化，發現使用P-SAX小柱（強陰離子交換柱）具有“化繁從簡”的神奇效果，大大提升做樣速度和回收效果~
以下是方法優化過程碰到的問題和一些思考分享，以供各位朋友參考交流~
凈化方法的選擇
首先，小編歸納了guo家標準中的不同基質樣品的提取、凈化方法。
果蔬汁、果蔬漿類樣品：
醬菜、發酵豆制品類樣品：
面包、糕點、焙烤食品餡料、復合調味料類樣品：
黃油類樣品：
不難看出，國標的處理方法核心思路為：堿性溶液提取，提取液用甲酸調節pH后凈化。部分類型樣品的凈化方法包括液液萃取（LLE）與固相萃取（SPE），如液液萃取法凈化后上機結果不理想，則使用C18小柱進行固相萃取。
我們都知道，耗時更短是SPE法相比LLE法的優勢之一，且國標方法中也提及，如果LLE法效果不理想可使用SPE法，說明SPE法凈化效果更有保證。
為了使檢測方法更加快速高效，小編使用固相萃取法作為凈化方法。
接下來小編將以國標方法12.1.1 為例進行方法驗證與方法優化。
方法驗證
為驗證國標方法中C18小柱的保留效果，小編先使用脫氫乙酸標準溶液進行方法驗證，確保現有實驗條件下，目標化合物使用該方法能被有效回收，才能用來進行樣品處理。
參考的國標方法如下：
實際操作中，小編做了兩個處理：
1、凈化處理：將脫氫乙酸標液按12.1.1步驟凈化，收集洗脫液過濾上機。
2、未凈化處理：等濃度標液作對照直接上機檢測。
來看一下經過凈化和未經過凈化的樣液脫氫乙酸的回收結果：
（注：藍色峰為脫氫乙酸標準溶液，黑色峰為洗脫液）
不難看出，收集到的洗脫液吸收峰變形嚴重。
考慮到兩者基質溶劑不同，需要考察溶劑對峰形的影響。
因此小編又取一定量的標準品儲備液，分別用水、70%甲醇溶液配制成濃度為1ppm的上樣溶液，上機測定結果，譜圖如下：
（其中藍色峰為純水基質，黑色峰為70%甲醇基質）
由圖可知，直接使用洗脫液上機會存在溶劑效應，需要將洗脫液中的甲醇除去，因此小編在洗脫步驟之后增加氮吹過程去除甲醇。
令小編沮喪的是，除去甲醇后，回收率仍然不理想（15.35%）。小編收集了上樣、淋洗步驟的流出液上機檢測，發現目標物未被檢出。結合上述實驗結果看，導致目標物回收率低的情況可能出現在提取環節或固相萃取洗脫環節，目標物可能仍保留在小柱上。
然而，整個操作過程實在太繁瑣、太不確定！再去追究哪一步出現問題要花大量時間！
綜合整個操作流程，涉及兩個調pH步驟，引入的誤差無法準確控制；樣品提取液較少的時，繁瑣的操作難免導致目標物損失。一方面，檢測結果準確度不好保障，另一方面，繁瑣的流程限制了做樣速度，增加方法改良的時間成本。這樣的方法即便有效也難實現大批量樣品的快速處理。
那么換個思路進行方法優化如何？
方法優化
小編想，既然原有操作復雜、回收效果也不理想，那么能否通過更換更合適的SPE小柱，實現對方法的整體優化，達到準確，高效的實驗效果？
小柱的選型要由目標物性質決定，小編首先看了一下脫氫乙酸的化學性質：
脫氫乙酸是吡喃的衍生物，常溫下呈晶體狀。脫氫乙酸晶體難溶于水，在甲醇中溶解度5%（w/w，25℃），水溶液弱酸性，飽和溶液pH=4。其鹽類脫氫乙酸鈉在水中溶解度較大。
脫氫乙酸
脫氫乙酸鈉
這里小編發現，脫氫乙酸是一種有機弱酸，其離子化狀態是弱陰離子。那么，如果能使脫氫乙酸在提取和固相萃取富集環節保持離子化狀態，是否可以利用離子交換機制選擇小柱呢？
考慮至此，小編選定了月旭P-SAX小柱（強陰離子交換柱）作為SPE凈化柱。使用P-SAX小柱回收脫氫乙酸時，需要注意兩個環節：
堿性環境中上樣（脫氫乙酸離子化，被小柱吸附）；
酸性環境中洗脫（脫氫乙酸變回中性分子，失去與小柱間的作用力，被洗脫）。
優化后
在進行了進一步優化后，更終的實驗步驟、譜圖、回收率如下（以洋蔥基質為例）：
1、提取
稱取2g樣品于50mL離心管，加入5mL氫氧化鈉溶液（1mol/L），定容至25mL，渦旋混勻2min，超聲提取15min，8000r/min離心5min，上清液待凈化。
2、凈化
SPE柱：月旭Welchrom? P-SAX，規格：200 mg/6mL。
活化：5mL甲醇，5mL水，棄去
上樣：10ml待凈化液上樣，棄去
淋洗：5mL水，棄去，抽干
洗脫：5mL10%甲酸甲醇，收集于15ml離心管中，抽干
濃縮：40℃氮吹至約200μL，用水定容至2ml，過0.45μm水系濾膜后上HPLC檢測。
3、儀器條件
色譜柱：月旭Ultimate?XB-C18, 4.6×250mm, 5μm
流動相：0.02mol/L乙酸銨（pH=10）：甲醇=35:65
柱溫：35℃
進樣量：20μL
檢測波長：484nm
流速：1.0mL/min
改進后的提取步驟避免了國標方法中兩次調節pH的繁瑣，操作快速、回收率更加理想。
小編后來又用黃油、辣條、面包、青團等樣品做了驗證，回收率和RSD均十分理想。
方法改良成功！（鼓掌~~~~）
總結：
在進行脫氫乙酸的檢測中，按方法開發步驟分別進行了洗脫液、SPE小柱類型、前處理方法優化。因此在某種目標物檢測方法改進時，需要針對目標物性質、SPE機制、實驗整體流程三個方面進行，且每一個步驟都需要摸索出z佳條件，從而得出一個穩定、高效的檢測方法。
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